उत्पादनहरू
२०१९-nCoV को लागि लाइफकोसम SARS-Cov-2-RT-PCR पत्ता लगाउने किट
अपेक्षित प्रयोग
यो किट घाँटीको स्वाब, नासोफरिन्जियल स्वाब, ब्रोन्कोआल्भियोलर ल्याभेज फ्लुइड, थुक प्रयोग गरेर नयाँ कोरोनाभाइरस (२०१९-nCoV) को गुणात्मक पहिचानको लागि प्रयोग गरिन्छ। यस उत्पादनको पत्ता लगाउने नतिजा केवल क्लिनिकल सन्दर्भको लागि हो, र यसलाई क्लिनिकल निदान र उपचारको लागि एक मात्र प्रमाणको रूपमा प्रयोग गर्नु हुँदैन। बिरामीको क्लिनिकल अभिव्यक्ति र अन्य प्रयोगशाला परीक्षणहरूसँग संयोजनमा अवस्थाको विस्तृत विश्लेषण सिफारिस गरिन्छ।
निरीक्षण सिद्धान्त
यो किट एक-चरण RT- PCR प्रविधिमा आधारित छ। वास्तवमा, २०१९ को नयाँ कोरोनाभाइरस (२०१९-nCoV) ORF1ab र N जीनहरूलाई प्रवर्धन लक्ष्य क्षेत्रको रूपमा चयन गरिएको थियो। विशिष्ट प्राइमरहरू र फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू (N जीन प्रोबहरूलाई FAM लेबल गरिएको छ र ORF1ab प्रोबहरूलाई HEX लेबल गरिएको छ) नमूनाहरूमा २०१९ नयाँ-प्रकारको कोरोनाभाइरस RNA पत्ता लगाउन डिजाइन गरिएको हो। किटमा नमूना सङ्कलन, RNA र PCR प्रवर्धनको प्रक्रियाको निगरानी गर्नको लागि अन्तर्जातीय आन्तरिक नियन्त्रण पत्ता लगाउने प्रणाली (CY5 लेबल गरिएको आन्तरिक नियन्त्रण जीन प्रोब) पनि समावेश छ, जसले गर्दा गलत नकारात्मक परिणामहरू कम हुन्छन्।
मुख्य घटकहरू
| अवयवहरू | भोल्युम(४८ टन/किट) |
| RT-PCR प्रतिक्रिया समाधान | ९६ माइक्रोलिटर |
| nCOV प्राइमर TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | ८६४µलिटर |
| नकारात्मक नियन्त्रण | १५०० माइक्रोलिटर |
| nCOV सकारात्मक नियन्त्रण (l ORF1ab N Gene) | १५०० माइक्रोलिटर |
आफ्नै अभिकर्मकहरू: आरएनए निकासी वा शुद्धीकरण अभिकर्मकहरू। नकारात्मक/सकारात्मक नियन्त्रण: सकारात्मक नियन्त्रण भनेको लक्षित खण्ड भएको आरएनए हो, जबकि नकारात्मक नियन्त्रण भनेको न्यूक्लिक एसिड-रहित पानी हो। प्रयोगको क्रममा, तिनीहरूले निकासीमा भाग लिनुपर्छ र संक्रामक मानिनुपर्छ। तिनीहरूलाई सम्बन्धित नियमहरू अनुसार ह्यान्डल र डिस्पोज गर्नुपर्छ।
आन्तरिक सन्दर्भ जीन मानव RnaseP जीन हो।
भण्डारण अवस्था र म्याद सकिने मिति
-२०±५℃, ५ पटक भन्दा बढी पटक पटक जम्ने र पग्लनेबाट बच्नुहोस्, ६ महिनाको लागि मान्य।
लागू हुने उपकरण
FAM / HEX / CY5 र अन्य बहु-च्यानल फ्लोरोसेन्ट PCR उपकरणको साथ।
नमूना आवश्यकताहरू
१. लागू हुने नमूना प्रकारहरू: घाँटीको स्वाब, नासोफरिन्जियल स्वाब, ब्रोन्कोआल्भियोलर ल्याभेज फ्लुइड, थुक।
२.नमूना सङ्कलन (एसेप्टिक प्रविधि)
फ्यारिङ्गियल स्वाब: टन्सिल र पोस्टरियर फ्यारिङ्गियल भित्तालाई एकै समयमा दुईवटा स्वाबले पुछ्नुहोस्, त्यसपछि स्वाबको टाउकोलाई नमूना घोल भएको टेस्ट ट्यूबमा डुबाउनुहोस्।
खकार: बिरामीलाई गहिरो खोकी लागेपछि, खोकिएको खकारलाई नमूना घोल भएको स्क्रू क्याप टेस्ट ट्यूबमा सङ्कलन गर्नुहोस्; ब्रोन्कोआल्भियोलर ल्याभेज फ्लुइड: चिकित्सा पेशेवरहरूद्वारा नमूना लिने। ३. नमूनाहरूको भण्डारण र ढुवानी
भाइरस आइसोलेसन र आरएनए परीक्षणको लागि नमूनाहरू सकेसम्म चाँडो परीक्षण गर्नुपर्छ। २४ घण्टा भित्र पत्ता लगाउन सकिने नमूनाहरू ४ डिग्री सेल्सियसमा भण्डारण गर्न सकिन्छ; २४ घण्टा भित्र पत्ता लगाउन नसकिने नमूनाहरू
घण्टा -७० डिग्री सेल्सियस वा सोभन्दा कम तापक्रममा भण्डारण गर्नुपर्छ (यदि -७० डिग्री सेल्सियसको भण्डारण अवस्था छैन भने, तिनीहरू हुनुपर्छ
अस्थायी रूपमा -२० डिग्री सेल्सियस फ्रिजमा भण्डारण गरिएको)। ढुवानीको समयमा नमूनाहरू बारम्बार जम्ने र पग्लनेबाट जोगिनुपर्छ। सङ्कलन पछि नमूनाहरू सकेसम्म चाँडो प्रयोगशालामा पठाउनुपर्छ। यदि नमूनाहरू लामो दूरीमा ढुवानी गर्न आवश्यक छ भने, सुख्खा बरफ भण्डारण गर्न सिफारिस गरिन्छ।
परीक्षण विधिहरू
१ नमूना प्रशोधन र आरएनए निकासी (नमूना प्रशोधन क्षेत्र)
आरएनए निकासीको लागि २००μl तरल पदार्थको नमूना लिन सिफारिस गरिन्छ। सम्बन्धित निकासी चरणहरूको लागि, व्यावसायिक आरएनए निकासी किटहरूको निर्देशनहरू हेर्नुहोस्। नकारात्मक र नकारात्मक दुवै
यस किटमा भएका नियन्त्रणहरू निकासीमा संलग्न थिए।
२ PCR अभिकर्मक तयारी (अभिकर्मक तयारी क्षेत्र)
२.१ किटबाट सबै कम्पोनेन्टहरू निकाल्नुहोस् र पगाल्नुहोस् र कोठाको तापक्रममा मिलाउनुहोस्। प्रयोग गर्नु अघि केही सेकेन्डको लागि ८,००० आरपीएममा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्; आवश्यक मात्रामा अभिकर्मकहरू गणना गर्नुहोस्, र प्रतिक्रिया प्रणाली निम्न तालिकामा देखाइए अनुसार तयार हुन्छ:
| अवयवहरू | नाइट्रोजन सर्विङ (२५µl प्रणाली) |
| nCOV प्राइमर TaqMan प्रोबमिक्श्चर | १८ μl × नाइट |
| RT-PCR प्रतिक्रिया समाधान | २ μl × नाइट |
| *N = परीक्षण गरिएका नमूनाहरूको संख्या + १ (नकारात्मक नियन्त्रण) + १ (nCOV)सकारात्मक नियन्त्रण) | |
२.२ कम्पोनेन्टहरूलाई राम्ररी मिसाएपछि, ट्यूबको भित्तामा रहेको सबै तरल पदार्थ ट्यूबको तल खस्न दिन छोटो समयको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, र त्यसपछि २० µl प्रवर्धन प्रणालीलाई PCR ट्यूबमा हाल्नुहोस्।
३ नमूना लिने (नमूना तयारी क्षेत्र)
निकासी पछि नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रणहरूको 5μl थप्नुहोस्। परीक्षण गरिने नमूनाको RNA PCR प्रतिक्रिया ट्यूबमा थपिएको छ।
ट्यूबलाई कसिलो गरी बन्द गर्नुहोस् र प्रवर्धन पत्ता लगाउने क्षेत्रमा स्थानान्तरण गर्नु अघि केही सेकेन्डको लागि ८,००० आरपीएममा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
४ PCR प्रवर्धन (प्रवर्द्धन गरिएको पत्ता लगाउने क्षेत्र)
४.१ प्रतिक्रिया ट्यूबलाई उपकरणको नमूना कक्षमा राख्नुहोस्, र निम्नानुसार प्यारामिटरहरू सेट गर्नुहोस्:
| चरण | साइकल नम्बर | तापक्रम(° सेल्सियस) | समय | सङ्ग्रहसाइट |
| उल्टोट्रान्सक्रिप्शन | 1 | 42 | १० मिनेट | - |
| पूर्व-विकृतिकरणn | 1 | 95 | १ मिनेट | - |
| साइकल | 45 | 95 | १५ सेकेन्ड | - |
| 60 | ३० को दशक | तथ्याङ्क सङ्कलन |
उपकरण पत्ता लगाउने च्यानल चयन: फ्लोरोसेन्स सिग्नलको लागि FAM、HEX、CY5 च्यानल चयन गर्नुहोस्। सन्दर्भको लागि फ्लोरोसेन्ट NONE, कृपया ROX नछोड्नुहोस्।
५ नतिजा विश्लेषण (सेटिङको लागि कृपया प्रत्येक उपकरणको प्रयोगात्मक निर्देशनहरू हेर्नुहोस्)
प्रतिक्रिया पछि, परिणामहरू बचत गर्नुहोस्। विश्लेषण पछि, छवि अनुसार आधार रेखाको सुरुवात मान, अन्त्य मान, र थ्रेसहोल्ड मान समायोजन गर्नुहोस् (प्रयोगकर्ताले वास्तविक अवस्था अनुसार समायोजन गर्न सक्छ, सुरुवात मान 3~15 मा सेट गर्न सकिन्छ, अन्त्य मान 5~20 मा सेट गर्न सकिन्छ, समायोजन)। विन्डोको थ्रेसहोल्डमा, थ्रेसहोल्ड रेखा लघुगणक चरणमा छ, र नकारात्मक नियन्त्रणको प्रवर्धन वक्र एक सीधा रेखा वा थ्रेसहोल्ड रेखा भन्दा तल छ)।
६ क्वाउटी नियन्त्रण（परीक्षणमा प्रक्रियागत नियन्त्रण समावेश गरिएको छ） नकारात्मक नियन्त्रण: FAM, HEX, CY5 पत्ता लगाउने च्यानलहरूको लागि कुनै स्पष्ट प्रवर्धन वक्र छैनn
COV सकारात्मक नियन्त्रण: FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरूको स्पष्ट प्रवर्धन वक्र, Ct मान≤32, तर CY5 च्यानलको कुनै प्रवर्धन वक्र छैन;
माथिका आवश्यकताहरू एउटै प्रयोगमा एकैसाथ पूरा गर्नुपर्छ; अन्यथा, प्रयोग अमान्य हुनेछ र दोहोर्याउनु पर्नेछ।
७ परिणामहरूको निर्धारण।
७.१ यदि परीक्षण नमूनाको FAM र HEX च्यानलहरूमा कुनै प्रवर्धन वक्र वा Ct मान> ४० छैन, र CY5 च्यानलमा प्रवर्धन वक्र छ भने, यो नमूनामा २०१९ को नयाँ कोरोनाभाइरस (२०१९-nCoV) RNA छैन भनेर निर्णय गर्न सकिन्छ;
.२ यदि परीक्षण नमूनामा FAM र HEX च्यानलहरूमा स्पष्ट प्रवर्धन वक्रहरू छन्, र Ct मान ≤40 छ भने, यो नमूना २०१९ नयाँ कोरोनाभाइरस (२०१९-nCoV) को लागि सकारात्मक छ भनेर निर्णय गर्न सकिन्छ।
७.३ यदि परीक्षण नमूनामा FAM वा HEX को एउटा च्यानलमा मात्र स्पष्ट प्रवर्धन वक्र छ, र Ct मान ≤40 छ, र अर्को च्यानलमा कुनै प्रवर्धन वक्र छैन भने, परिणामहरू पुन: परीक्षण गर्न आवश्यक छ। यदि पुन: परीक्षण परिणामहरू एकरूप छन् भने, नमूनालाई नयाँको लागि सकारात्मक मान्न सकिन्छ।
कोरोनाभाइरस २०१९ (२०१९-nCoV)। यदि पुन: परीक्षणको नतिजा नकारात्मक छ भने, यो नमूना २०१९ नयाँ कोरोनाभाइरस (२०१९-nCoV) को लागि नकारात्मक छ भनेर निर्णय गर्न सकिन्छ।
सकारात्मक निर्णय मान
किटको सन्दर्भ CT मान निर्धारण गर्न ROC कर्भ विधि प्रयोग गरिन्छ र आन्तरिक नियन्त्रण सन्दर्भ मान ४० हो।
परीक्षण परिणामहरूको व्याख्या
१.प्रत्येक प्रयोगलाई नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रणहरूको लागि परीक्षण गरिनुपर्छ। परीक्षण परिणामहरू केवल तब मात्र निर्धारण गर्न सकिन्छ जब नियन्त्रणहरूले गुणस्तर नियन्त्रण आवश्यकताहरू पूरा गर्छन्।
२. जब FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरू सकारात्मक हुन्छन्, प्रणाली प्रतिस्पर्धाको कारणले CY5 च्यानल (आन्तरिक नियन्त्रण च्यानल) बाट नतिजा नकारात्मक हुन सक्छ।
३. आन्तरिक नियन्त्रण नतिजा नकारात्मक हुँदा, यदि परीक्षण ट्यूबको FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरू पनि नकारात्मक छन् भने, यसको अर्थ प्रणाली असक्षम पारिएको छ वा सञ्चालन गलत छ, परीक्षण अमान्य छ। त्यसैले, नमूनाहरू पुन: परीक्षण गर्न आवश्यक छ।
