उत्पादनहरू
2019-nCoV को लागि Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR पत्ता लगाउने किट
अपेक्षित उपयोग
यो किट नयाँ कोरोनाभाइरस (2019-nCoV) को गुणात्मक पत्ता लगाउनको लागि थ्रोट स्वाब, नासोफरिन्जियल स्वाब्स, ब्रोन्कोआल्भियोलर ल्याभज फ्लुइड, स्पुटम प्रयोग गरी प्रयोग गरिन्छ। यो उत्पादनको पत्ता लगाउने नतिजा क्लिनिकल सन्दर्भको लागि मात्र हो, र यसलाई मात्र प्रयोग गर्नु हुँदैन। क्लिनिकल निदान र उपचारको लागि प्रमाण। रोगीको क्लिनिकल अभिव्यक्तिहरू र अन्य प्रयोगशाला परीक्षणहरूसँग संयोजनमा अवस्थाको व्यापक विश्लेषण सिफारिस गरिन्छ।
निरीक्षण सिद्धान्त
किट एक-चरण RT-PCR प्रविधिमा आधारित छ।वास्तवमा, 2019 नयाँ कोरोनाभाइरस (2019-nCoV) ORF1ab र N जीनहरू प्रवर्धन लक्ष्य क्षेत्रहरूको रूपमा चयन गरिएको थियो।विशिष्ट प्राइमर र फ्लोरोसेन्ट प्रोबहरू (N जीन प्रोबहरू FAM र ORF1ab प्रोबहरूलाई HEX ले लेबल लगाइन्छ) नमूनाहरूमा 2019 नयाँ-प्रकारको कोरोनाभाइरस आरएनए पत्ता लगाउन डिजाइन गरिएको हो।नमूना सङ्कलन, RNA र PCR एम्प्लीफिकेशनको प्रक्रियालाई अनुगमन गर्नका लागि किटमा अन्तर्जात आन्तरिक नियन्त्रण पत्ता लगाउने प्रणाली (CY5 ले लेबल गरिएको आन्तरिक नियन्त्रण जीन प्रोब) पनि समावेश छ, जसले गर्दा गलत नकारात्मक नतिजाहरू कम हुन्छ।
मुख्य अवयवहरू
| अवयवहरू | भोल्युम(48T/किट) |
| RT-PCR प्रतिक्रिया समाधान | ९६µl |
| nCOV प्राइमर TaqMan probemixture (ORF1ab, N Gene, RnaseP Gene) | ८६४µl |
| नकारात्मक नियन्त्रण | 1500µl |
| nCOV सकारात्मक नियन्त्रण (l ORF1ab N Gene) | 1500µl |
आफ्नै अभिकर्मकहरू: आरएनए निकासी वा शुद्धीकरण अभिकर्मकहरू।नकारात्मक/सकारात्मक नियन्त्रण: सकारात्मक नियन्त्रण भनेको लक्ष्य टुक्रा भएको आरएनए हो, जबकि नकारात्मक नियन्त्रण न्यूक्लिक एसिड-मुक्त पानी हो।प्रयोगको क्रममा, तिनीहरू निकासीमा भाग लिनुपर्दछ र संक्रामक मान्नु पर्छ।तिनीहरूलाई सम्बद्ध नियमहरू बमोजिम ह्यान्डल र निपटान गरिनु पर्छ।
आन्तरिक सन्दर्भ जीन मानव RnaseP जीन हो।
भण्डारण अवस्था र म्याद समाप्ति मिति
-20 ± 5 ℃, 5 पटक भन्दा बढी दोहोर्याइएको चिसो र पग्लनबाट बच्नुहोस्, 6 महिनाको लागि मान्य।
लागू हुने साधन
FAM / HEX / CY5 र अन्य बहु-च्यानल फ्लोरोसेन्ट PCR उपकरण संग।
नमूना आवश्यकताहरू
1. लागू हुने नमूना प्रकारहरू: घाँटी स्वाब, नासोफरिन्जियल स्वाब्स, ब्रोन्कोआल्भियोलर ल्याभज फ्लुइड, स्पुटम।
2. नमूना सङ्कलन (एसेप्टिक प्रविधि)
फरिन्जियल स्वाब: टन्सिल र पोस्टरियर फरिन्जियल पर्खाललाई एकै समयमा दुईवटा स्वाबले पुछ्नुहोस्, त्यसपछि स्वाबको टाउकोलाई नमूना समाधान भएको टेस्ट ट्यूबमा डुबाउनुहोस्।
थुक: बिरामीलाई गहिरो खोकी लागेपछि, खोकीको थूकलाई नमूनाको घोल भएको स्क्रू क्याप टेस्ट ट्यूबमा जम्मा गर्नुहोस्;ब्रोन्कोआल्भियोलर लभेज फ्लुइड: चिकित्सा पेशेवरहरू द्वारा नमूना।3. नमूनाहरूको भण्डारण र ढुवानी
भाइरस आइसोलेसन र आरएनए परीक्षणका लागि नमूनाहरू जतिसक्दो चाँडो परीक्षण गरिनुपर्छ।24 घण्टा भित्र पत्ता लगाउन सकिने नमूनाहरू 4℃ मा भण्डारण गर्न सकिन्छ;जुन 24 भित्र पत्ता लगाउन सकिँदैन
घण्टा -70℃ वा तल भण्डारण गरिनु पर्छ (यदि त्यहाँ -70℃ को कुनै भण्डारण अवस्था छैन भने, तिनीहरू हुनुपर्छ
अस्थायी रूपमा -20℃ फ्रिज) मा भण्डारण।नमूनाहरू ढुवानीको समयमा बारम्बार चिसो र पग्लिनबाट जोगिनु पर्छ।नमूना संकलन पछि जतिसक्दो चाँडो प्रयोगशालामा पठाउनुपर्छ।यदि नमूनाहरू लामो दूरीमा ढुवानी गर्न आवश्यक छ भने, सुख्खा बरफ भण्डारण सिफारिस गरिन्छ।
परीक्षण विधिहरू
१ नमूना प्रशोधन र आरएनए निकासी (नमूना प्रशोधन क्षेत्र)
RNA निकासीको लागि 200μl तरल नमूना लिन सिफारिस गरिन्छ।सम्बन्धित निकासी चरणहरूको लागि, व्यावसायिक RNA निकासी किटहरूको निर्देशनहरू हेर्नुहोस्।नकारात्मक र नकारात्मक दुवै
यस किटमा भएका नियन्त्रणहरू निकासीमा संलग्न थिए।
2 PCR अभिकर्मक तयारी (अभिकर्मक तयारी क्षेत्र)
2.1 किटबाट सबै कम्पोनेन्टहरू हटाउनुहोस् र कोठाको तापक्रममा पगाल्नुहोस् र मिश्रण गर्नुहोस्।प्रयोग गर्नु अघि केही सेकेन्डको लागि 8,000 rpm मा अपकेंद्रित्र;अभिकर्मकहरूको आवश्यक मात्रा गणना गर्नुहोस्, र निम्न तालिकामा देखाइए अनुसार प्रतिक्रिया प्रणाली तयार गरिएको छ:
| अवयवहरू | N सेवा (25µl प्रणाली) |
| nCOV प्राइमर TaqMan प्रोबमिक्श्चर | १८ µl × N |
| RT-PCR प्रतिक्रिया समाधान | २ µl × N |
| *N = परीक्षण गरिएका नमूनाहरूको संख्या + 1 (नकारात्मक नियन्त्रण) + 1 (nCOVसकारात्मक नियन्त्रण) | |
२.२ कम्पोनेन्टहरू राम्ररी मिसाएपछि, ट्यूबको भित्तामा भएका सबै तरल पदार्थलाई ट्यूबको तल्लो भागमा खस्न दिनको लागि छोटो समयको लागि सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्, र त्यसपछि 20 μl एम्प्लीफिकेशन प्रणालीलाई PCR ट्यूबमा राख्नुहोस्।
3 नमूना (नमूना तयारी क्षेत्र)
निकासी पछि नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रणहरूको 5μl थप्नुहोस्।परीक्षण गरिने नमूनाको आरएनए PCR प्रतिक्रिया ट्यूबमा थपिन्छ।
ट्युबलाई बलियोसँग क्याप गर्नुहोस् र एम्प्लीफिकेशन पत्ता लगाउने क्षेत्रमा स्थानान्तरण गर्नु अघि केही सेकेन्डका लागि 8,000 आरपीएममा सेन्ट्रीफ्यूज गर्नुहोस्।
4 PCR प्रवर्धन (एम्प्लीफाइड पत्ता लगाउने क्षेत्र)
4.1 इन्स्ट्रुमेन्टको नमूना कक्षमा प्रतिक्रिया ट्यूब राख्नुहोस्, र निम्नानुसार प्यारामिटरहरू सेट गर्नुहोस्:
| चरण | साइकल संख्या | तापक्रम(°C) | समय | सङ्कलनसाइट |
| उल्टोट्रान्सक्रिप्शन | 1 | 42 | १० मिनेट | - |
| पूर्व-विच्छेदनn | 1 | 95 | १ मिनेट | - |
| साइकल | 45 | 95 | १५ सेकेन्ड | - |
| 60 | ३० सेकेन्ड | तथ्यांक संकलन |
उपकरण पत्ता लगाउने च्यानल चयन: प्रतिदीप्ति संकेतको लागि FAM、HEX、CY5 च्यानल चयन गर्नुहोस्।सन्दर्भ फ्लोरोसेन्ट NONE को लागी, कृपया ROX छनौट नगर्नुहोस्।
५ परिणाम विश्लेषण (कृपया सेटिङका लागि प्रत्येक उपकरणको प्रयोगात्मक निर्देशनहरू हेर्नुहोस्)
प्रतिक्रिया पछि, परिणाम बचत गर्नुहोस्।विश्लेषण पछि, छवि अनुसार आधारभूत मूल्य, अन्त्य मान, र थ्रेसहोल्ड मान समायोजन गर्नुहोस् (प्रयोगकर्ताले वास्तविक स्थिति अनुसार समायोजन गर्न सक्छ, सुरु मान 3 ~ 15 मा सेट गर्न सकिन्छ, अन्त्य मान सेट गर्न सकिन्छ। 5~20, समायोजन) लोगारिदमिक ग्राफमा सञ्झ्यालको थ्रेसहोल्डमा, थ्रेसहोल्ड रेखा लोगारिदमिक चरणमा छ, र नकारात्मक नियन्त्रणको एम्प्लीफिकेशन वक्र सीधा रेखा वा थ्रेसहोल्ड रेखा मुनि छ)।
6 क्वाउटी नियन्त्रण（परीक्षणमा एक प्रक्रियात्मक नियन्त्रण समावेश गरिएको छ） नकारात्मक नियन्त्रण: FAM, HEX, CY5 पत्ता लगाउने च्यानलहरूको लागि कुनै स्पष्ट प्रवर्धन वक्र छैन।
COV सकारात्मक नियन्त्रण: FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरूको स्पष्ट प्रवर्धन कर्भ, Ct value≤32, तर CY5 च्यानलको कुनै प्रवर्धन वक्र छैन;
माथिका आवश्यकताहरू एउटै प्रयोगमा एकैसाथ पूरा गर्नुपर्छ;अन्यथा, प्रयोग अमान्य छ र दोहोर्याउन आवश्यक छ।
7 परिणामहरूको निर्धारण।
7.1 यदि परीक्षण नमूनाको FAM र HEX च्यानलहरूमा एम्प्लीफिकेशन कर्भ वा Ct मान> 40 छैन, र CY5 च्यानलमा एम्प्लीफिकेशन कर्भ छ भने, यो अनुमान गर्न सकिन्छ कि त्यहाँ कुनै 2019 नयाँ कोरोनाभाइरस (2019-nCoV) छैन। नमूनामा आरएनए;
.2 यदि परीक्षण नमूनामा FAM र HEX च्यानलहरूमा स्पष्ट एम्प्लीफिकेशन कर्भहरू छन्, र Ct मान ≤40 छ भने, यो 2019 नयाँ कोरोनाभाइरस (2019-nCoV) को लागि नमूना सकारात्मक छ भनेर अनुमान गर्न सकिन्छ।
7.3 यदि परीक्षण नमूनामा FAM वा HEX को एउटा च्यानलमा मात्र स्पष्ट प्रवर्द्धन कर्भ छ, र Ct मान ≤40 छ, र अर्को च्यानलमा कुनै प्रवर्द्धन कर्भ छैन भने, परिणामहरू पुन: परीक्षण गर्न आवश्यक छ।यदि पुन: परीक्षण परिणामहरू एकरूप छन् भने, नमूनालाई नयाँको लागि सकारात्मक मान्न सकिन्छ
कोरोनाभाइरस 2019 (2019-nCoV)।यदि पुन: परीक्षणको नतिजा नेगेटिभ आयो भने, यो अनुमान गर्न सकिन्छ कि नमूना 2019 नयाँ कोरोनाभाइरस (2019-nCoV) को लागि नकारात्मक छ।
सकारात्मक निर्णय मूल्य
आरओसी कर्भ विधि किटको सन्दर्भ CT मान निर्धारण गर्न प्रयोग गरिन्छ र आन्तरिक नियन्त्रण सन्दर्भ मान 40 हो।
परीक्षण परिणाम को व्याख्या
1. प्रत्येक प्रयोग नकारात्मक र सकारात्मक नियन्त्रण को लागी परीक्षण गरिनु पर्छ।नियन्त्रणहरूले गुणस्तर नियन्त्रण आवश्यकताहरू पूरा गर्दा मात्र परीक्षण परिणामहरू निर्धारण गर्न सकिन्छ
2. जब FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरू सकारात्मक हुन्छन्, CY5 च्यानल (आन्तरिक नियन्त्रण च्यानल) को परिणाम प्रणाली प्रतिस्पर्धाको कारणले नकारात्मक हुन सक्छ।
3. जब आन्तरिक नियन्त्रण परिणाम नकारात्मक छ, यदि t परीक्षण ट्यूबको FAM र HEX पत्ता लगाउने च्यानलहरू पनि नकारात्मक छन् भने, यसको मतलब प्रणाली असक्षम छ वा सञ्चालन गलत छ, t परीक्षण अमान्य छ।त्यसैले, नमूनाहरू पुन: परीक्षण गर्न आवश्यक छ।
